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1.ELISA試劑盒在酶標(biāo)包被板上設(shè)規(guī)范品孔10孔，在、第二孔中別離加規(guī)范品100μl，然后在、第二孔中加規(guī)范品稀釋液50μl，混勻；然后從孔、第二孔中各取100μl別離加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔別離加規(guī)范品稀釋液50μl，ELISA試劑盒混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl別離加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中別離加規(guī)范品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl別離加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中別離加規(guī)范品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中別離取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔別離加規(guī)范品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度別離為30ng/L，20ng/L ，10ng/L，5ng/L， 2.5ng/L）。
2. 加樣：ELISA試劑盒別離設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其他各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，ELISA試劑盒然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，悄悄晃動(dòng)混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4. 配液：將20倍濃縮洗刷液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
5. 洗刷：當(dāng)心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗刷液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
6. 加酶：每孔參加酶標(biāo)試劑50μl，空白孔在外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗刷：操作同5。
9. 顯色：每孔先參加顯色劑A50μl，再參加顯色劑B50μl，悄悄震動(dòng)混勻，37℃避光顯色15分鐘.
10. 停止：每孔加停止液50μl，停止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)）。
11.ELISA試劑盒測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加停止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。