ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)沒有檢測(cè)到陽性信號(hào)的原因?
可能原因有
①一抗和二抗不匹配
②沒有足夠的一抗和二抗來結(jié)合目標(biāo)蛋白
③封閉劑與一抗或二抗有交叉反應(yīng)
④一抗不識(shí)別待檢物種蛋白
⑤抗原量不足
⑥組織中目的蛋白含量低
⑦轉(zhuǎn)膜不充分
⑧洗膜過度
⑨過度封閉使目標(biāo)蛋白不能顯色
⑩一抗失效
相應(yīng)的處理辦法分別是
①保證二抗與一抗宿主物種相同(如一抗來自小鼠，二抗須為抗小鼠抗體)
②使用高濃度抗體，4℃延長(zhǎng)孵育時(shí)間(如過夜)
③使用溫和的去污劑如吐溫-20或更換封閉劑(脫脂奶粉、BSA、明膠等)
④參照況明書，比對(duì)免疫原序列和蛋白序列以確保抗體和目的蛋白會(huì)發(fā)生反應(yīng)，設(shè)置陽性對(duì)照
⑤保證每條泳道蛋白上樣量不低于20-30μg，使用蛋白酶抑制劑并設(shè)置陽性對(duì)照
⑥ 濃縮樣本使信號(hào)zui大化
⑦使用可逆染色劑如立春紅S檢測(cè)轉(zhuǎn)膜結(jié)果，檢查轉(zhuǎn)膜操作是否正確
⑧適度洗膜
⑨預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇合適的封閉劑或縮短封閉時(shí)間
⑩使用新鮮抗體，重復(fù)使用有效濃度會(huì)降低?
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